ER膜上ドメインの存在とMCSにおける意義 (PNAS 2020年3月16日号掲載論文)

結論から言うと、細胞が低張で膨潤した際に、ER及び他のオルガネラが巨大小胞の形に転移することを示し、その系を利用して、
［ERとmito, lipid droplet, endosome, PMとのコンタクトサイト］はLo ドメインを基点に形成され、［ERとlyso, peroxisomeとのコンタクトサイト］はLdドメインを基点に形成される、
ということを示した論文。

本日は「ER membranes exhibit phase behavior at sites of organelle contact (ER膜はオルガネラ接触部位で相状態の挙動を示す[*「相状態」というとよく分からないかもしれませんが、「膜は一様ではなく、特定の要素で定義されるドメインがある」くらいの意味だと思います]）」という論文で、Janelia Research Campus, HHMI の Arnold Y. Seo 及び Jennifer Lippincott-Schwartz のグループによる研究。（論文サイトへのlink→*1）

違うオルガネラが異なるドメインとinteractするというのは、認識テザリングたんぱく質が鍵と鍵穴のような関係になっているのでしょうか？面白いですね。

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

The endoplasmic reticulum (ER) is the site of synthesis of secretory and membrane proteins and contacts every organelle of the cell, exchanging lipids and metabolites in a highly regulated manner. How the ER spatially segregates its numerous and diverse functions, including positioning nanoscopic contact sites with other organelles, is unclear. We demonstrate that hypotonic swelling of cells converts the ER and other membrane-bound organelles into micrometer-scale large intracellular vesicles (LICVs) that retain luminal protein content and maintain contact sites with each other through localized organelle tethers. Upon cooling, ER-derived LICVs phase-partition into microscopic domains having different lipid-ordering characteristics, which is reversible upon warming. Ordered ER lipid domains mark contact sites with ER and mitochondria, lipid droplets, endosomes, or plasma membrane, whereas disordered ER lipid domains mark contact sites with lysosomes or peroxisomes. Tethering proteins concentrate at ER–organelle contact sites, allowing time-dependent behavior of lipids and proteins to be studied at these sites. These findings demonstrate that LICVs provide a useful model system for studying the phase behavior and interactive properties of organelles in intact cells.

(私訳と勝手な注釈) 

小胞体（小胞体）は、分泌タンパク質や膜タンパク質の合成部位であり、細胞内のあらゆる小器官と接触し、高度に制御された方法で脂質や代謝物を交換している。小胞体がどのようにして「他の小器官とのナノスケールのMCS形成・配置」を含めた多様な機能を空間的に分離しているのかは明らかになっていない。本研究では、細胞を低張で膨潤させる[*浸透圧によって水分が細胞に流入し、細胞が膨張する]ことで、ER及びその他のオルガネラがmicrometer-scale large intracellular vesicles（マイクロメートルスケールの大細胞内小胞）（LICVs）に変換され、小器官の局所的なテザリング分子を介して、内腔内のタンパク質含有量を保持し、互いに接触部位を維持することを実証した。冷却すると、ER由来のLICVは、異なる脂質の組成からなるliquid-ordered (Lo) microdomainsに相分離するが、これは温めると可逆的である。Lo microdomains（秩序化されたER脂質ドメイン）は、ERとミトコンドリア、lipid droplet、エンドソーム、またはendosomeとの接触部位を示すのに対し、Ld microdomains（無秩序化されたER脂質ドメイン）は、リソソソームまたはペルオキシソームとの接触部位を示す。本研究により、脂質とタンパク質の時間依存的な挙動を調べることができるようになった。これらの知見は、LICVがインタクトな細胞内の小器官の相挙動や相互作用特性を研究するための有用なモデルシステムになることを示している。

本筋と関係ない余談1：
論文読みのブログ更新に間隔が開いてしまいました！それでも昔の自分なら理由をつけて論文読みoutputの更新をストップしていたと思います。過去に全くそれと同じ失敗と挫折をしたので、間をあけつつも更新再開できるメンタルになってます。やっぱり、最速で小さな失敗を積み重ねることこそが、成功への一番の近道なんだなぁと感じております。

本筋と関係ない余談2：
Google翻訳から、DeepLを使うように変えてみます！どれくらい手間が変わったか、今後レポートしてみます！

*1:https://www.pnas.org/content/early/2020/03/13/1910854117

細胞老化を味方に筋再生を促す (Nature Communications 2020年2月14日号掲載論文)

結論から言うと、エクササイズをしたとき、間葉系前駆細胞が「細胞老化」を起こし、免疫細胞を動員することで老化細胞をクリアランスすることが、筋の再生・肥大を促すことを示した論文。

本日は「Exercise enhances skeletal muscle regeneration by promoting senescence in fibroadipogenic progenitors (エクササイズは間葉系前駆細胞の細胞老化を促進することで骨格筋の再生を促す）」という論文で、札幌医科大学医学部解剖学第二講座 の 千見寺(齋藤)貴子 のグループによる研究。（論文サイトへのlink→*1）

細胞老化を目印として、免疫細胞を集めてクリアランスをすることで、筋再生&肥大を誘導するという流れがきれいだなと思いました。細胞老化は余計なところにまで免疫細胞をリクルートして炎症を誘導する悪いヤツなのかな？というざっくりしたイメージでしたが、クリアランスという観点で考えると、今回のようにポジティブに働くこともあるのですねぇ。

気になったのが、老化細胞を全身から除去したマウスとかだと、この系が一切動かなくなるので、エクササイズで線維化しやすかったりするのですかね？

興味を持たれた方は、今日はabstractの代わりに日本語プレスリリースのリンクをどうぞ。こちら。

*1:https://www.nature.com/articles/s41467-020-14734-x

ERストレスセンサーがER-PM間MCSを調節する (Molecular Cell 2017年3月2日号掲載論文)

結論から言うと、ERストレスセンサーであるPERKがアクチン結合タンパク質フィラミンAと相互作用していることを同定し、ER Ca欠乏・細胞質 Caリッチな状況で、PERK-FLNA相互作用がER-PM間MCS形成を促進することを示した論文。

本日は「The ER Stress Sensor PERK Coordinates ER-Plasma Membrane Contact Site Formation through Interaction with Filamin-A and F-Actin Remodeling (ERストレスセンサーPERKは、フィラミンAとの相互作用およびFアクチンリモデリングを通してER-PM膜接触部位形成を調整する」という論文で、ベルギー Laboratory of Cell Death Research and Therapy, Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven の Dr. Patrizia Agostinis のグループによる研究。（論文サイトへのlink→*1）

やっぱりコンタクトサイトの議論をしたいときに、細胞骨格の話は外せないなぁと思いました。 

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

Loss of ER Ca2+ homeostasis triggers endoplasmic reticulum (ER) stress and drives ER-PM contact sites formation in order to refill ER-luminal Ca2+. Recent studies suggest that the ER stress sensor and mediator of the unfolded protein response (UPR) PERK regulates intracellular Ca2+ fluxes, but the mechanisms remain elusive. Here, using proximity-dependent biotin identification (BioID), we identified the actin-binding protein Filamin A (FLNA) as a key PERK interactor. Cells lacking PERK accumulate F-actin at the cell edges and display reduced ER-PM contacts. Following ER-Ca2+ store depletion, the PERK-FLNA interaction drives the expansion of ER-PM juxtapositions by regulating F-actin-assisted relocation of the ER-associated tethering proteins Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1) and Extended Synaptotagmin-1 (E-Syt1) to the PM. Cytosolic Ca2+ elevation elicits rapid and UPR-independent PERK dimerization, which enforces PERK-FLNA-mediated ER-PM juxtapositions. Collectively, our data unravel an unprecedented role of PERK in the regulation of ER-PM appositions through the modulation of the actin cytoskeleton.

(私訳と勝手な注釈) 

ER Ca 2+ホメオスタシスの喪失（ERにおけるCaイオン濃度の低下）は、小胞体（ER）ストレスを引き起こし、ER内腔Ca 2+を補充するためにER-PM膜接触部位(MCS)の形成を促進します。最近の研究では、小胞体ストレスセンサー、および変性タンパク質応答（UPR）のメディエーターたんぱく質であるPERKが、細胞内Ca 2+フラックスを調節していることが報告されていますが、その詳細なメカニズムは明らかとなっていません。本研究では、近接依存性ビオチン識別（BioID）法を使用して、主要なPERK相互作用因子としてアクチン結合タンパク質フィラミンA（FL​​NA）を同定しました。 PERKを欠く細胞は、細胞縁にF-アクチンを蓄積し、ER-PM接触の減少を示します。 ERにおけるCa2 +の枯渇により、PERK-FLNA相互作用が誘導され、[ER関連テザリングタンパク質: StromalInteraction Molecule 1（STIM1）およびExtended Synaptotagmin-1（E- Syt1）]の再配置をF-actinを介して調節することにより、ER-PM間MCSが拡大します。サイトゾルのCa 2+上昇は、迅速かつUPRに依存しないPERKの二量化を誘導し、PERK-FLNAを介したER-PM間MCSを増強します。以上より、これらのデータは、アクチン細胞骨格の変調を介したER-PM間MCSの調節におけるPERKの意外な役割を明らかにしました。

*1:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276517300461#undfig1

細胞が老化する過程で、ピルビン酸をアセチルCoAに代謝する反応が促進する (Nature 2013年5月19日号掲載論文)

結論から言うと、がん遺伝子誘発性細胞老化（OIS）状態において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)が活性化し、TCAサイクルが亢進して細胞にストレスがかかっていることを示した論文。

本日は「A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence (がん遺伝子誘発性細胞老化（OIS）におけるミトコンドリアゲートキーパーピルビン酸デヒドロゲナーゼの重要な役割)」という論文で、オランダ Division of Molecular Oncology, The Netherlands Cancer Institute の Dr. Daniel S. Peeper のグループによる研究。（論文サイトへのlink→*1）

ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ピルビン酸をアセチルCoAに変換する経路の酵素で、解糖系とクエン酸回路（TCA回路）を繋げる役割を果たします。細胞老化と代謝の関係について知らなかったので、こちらの総説をやこちらの総説を読みました。

発がん遺伝子ストレスで酸化ストレスを引き起こしてチェックポイントを止めているという現象の間にはPDHの活性化が重要ということですね。

アブストを読んでいて、細胞老化と細胞のがん化が綱引きをしているようなイメージができました。

逆に、PDHを抑制すると酸化ストレスが減るので細胞老化は起きないけれど、発がん遺伝子ストレスでそのままがん化してしまうという感じでしょうか。

（レビューを読んで思ったことですが、解糖系を亢進させると細胞老化や酸化ストレスが抑圧されるとのことなので、解糖系とTCAサイクルはしっかり別で考えないといけませんね。）

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

In response to tenacious stress signals, such as the unscheduled activation of oncogenes, cells can mobilize tumour suppressor networks to avert the hazard of malignant transformation. A large body of evidence indicates that oncogene-induced senescence (OIS) acts as such a break, withdrawing cells from the proliferative pool almost irreversibly, thus crafting a vital pathophysiological mechanism that protects against cancer1,2,3,4,5. Despite the widespread contribution of OIS to the cessation of tumorigenic expansion in animal models and humans, we have only just begun to define the underlying mechanism and identify key players6. Although deregulation of metabolism is intimately linked to the proliferative capacity of cells7,8,9,10, and senescent cells are thought to remain metabolically active11, little has been investigated in detail about the role of cellular metabolism in OIS. Here we show, by metabolic profiling and functional perturbations, that the mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase (PDH) is a crucial mediator of senescence induced by BRAFV600E, an oncogene commonly mutated in melanoma and other cancers. BRAFV600E-induced senescence was accompanied by simultaneous suppression of the PDH-inhibitory enzyme pyruvate dehydrogenase kinase 1 (PDK1) and induction of the PDH-activating enzyme pyruvate dehydrogenase phosphatase 2 (PDP2). The resulting combined activation of PDH enhanced the use of pyruvate in the tricarboxylic acid cycle, causing increased respiration and redox stress. Abrogation of OIS, a rate-limiting step towards oncogenic transformation, coincided with reversion of these processes. Further supporting a crucial role of PDH in OIS, enforced normalization of either PDK1 or PDP2 expression levels inhibited PDH and abrogated OIS, thereby licensing BRAFV600E-driven melanoma development. Finally, depletion of PDK1 eradicated melanoma subpopulations resistant to targeted BRAF inhibition, and caused regression of established melanomas. These results reveal a mechanistic relationship between OIS and a key metabolic signalling axis, which may be exploited therapeutically.

(私訳と勝手な注釈) 

がん遺伝子の予定外の活性化などによる持続的なストレス信号に応答して、細胞は腫瘍抑制経路を動員して悪性形質転換（*がん化）の危険を回避しています。がん遺伝子誘発性細胞老化（OIS）はそのような危機回避として作用し、増殖プールから細胞増殖を不可逆的に停止するという多くの証拠があり、OISは生体をがんから保護する重要な病態生理学的メカニズムです。動物モデルおよびヒトの腫瘍形成拡大の停止においてOISが重要な役割を果たしている一方で、根底にあるメカニズム、主要な構成因子は特定され始めたばかりです。代謝の調節解除は細胞の増殖能と密接に関連しており（*例えばがん細胞では代謝の規制が解除されるので、無限に増殖してしまうということ）、老化細胞は代謝的に活性を持つと考えられていますが、OISにおける細胞代謝の役割についてはほとんど研究されていません。この論文では、代謝物プロファイリングと機能的欠損実験により、ミトコンドリアゲートキーパーであるピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）が、メラノーマや他の癌で一般的に変異する癌遺伝子であるBRAF(V600E)によって誘導される老化の、重要なメディエーターであることを示します。 BRAF(V600E)によって細胞老化が起きる際、「PDHを阻害する酵素であるピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ1（PDK1）の抑制」と「PDHを活性化する酵素であるピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファターゼ2（PDP2）の誘導」が同時に引き起こされました（*PDHのブレーキを外してアクセルも踏む、という状況）。その結果、PDHの複合活性化により、TCAサイクルでのピルビン酸の使用が強化され、呼吸および酸化還元ストレスが増加しました。発癌性形質転換への律速段階であるOISの廃止は、これらのプロセスの逆の反応が起きました。PDK1またはPDP2の発現レベルを強制的にノーマライズすると、PDHが阻害されることでOISが停止し、BRAF(V600E)によるメラノーマが発生しました。PDK1を欠損させると、標的BRAF阻害に耐性を示す黒色腫亜集団を根絶し、すでに確立した黒色腫を抑圧しました。これらの結果は、OISと重要な代謝シグナル伝達軸との間の関係を明らかにしており、これは治療的に活用することができるかもしれません。

*1:https://www.nature.com/articles/nature12154

トランスグルタミナーゼがER-mito間MCSの形成を制御する (Cell Reports 2018年12月26日号掲載論文)

結論から言うと、トランスグルタミナーゼ2がIP3R-GRP75-VDAC複合体の制御を通して、ER-mito間MCSの形成を亢進させ、ERからmitoへのCaフラックスを調節していることを示唆した論文。

本日は「Transglutaminase Type 2 Regulates ER-Mitochondria Contact Sites by Interacting with GRP75 (トランスグルタミナーゼタイプ2は、GRP75との相互作用によりER-ミトコンドリアの膜接触部位を調節する)」という論文で、イタリア Department of Biology, University of Rome “Tor Vergata,” の Dr. Mauro Piacentini のグループによる研究。（論文サイトへのlink→*1）

トランスグルタミナーゼについて知らなかったので、こちらの総説を読みました。
トランスグルタミナーゼは蛋白質中のグルタミン残基とリシン残基との間にイソペプチ ド結合を形成し、タンパク質の架橋構造の形成を促進するようです。他にも様々な機能があるようです。

トランスグルタミナーゼがMAMを制御する意義というのがよく分からなかったです。

論文サイトからgraphical abstを引用します

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

Transglutaminase type 2 (TG2) is a multifunctional enzyme that plays a key role in mitochondria homeostasis under stressful cellular conditions. TG2 interactome analysis reveals an enzyme interaction with GRP75 (glucose-regulated protein 75). GRP75 localizes in mitochondria-associated membranes (MAMs) and acts as a bridging molecule between the two organelles by assembling the IP3R-GRP75-VDAC complex, which is involved in the transport of Ca2+ from the endoplasmic reticulum (ER) to mitochondria. We demonstrate that the TG2 and GRP75 interaction occurs in MAMs. The absence of the TG2-GRP75 interaction leads to an increase of the interaction between IP3R-3 and GRP75; a decrease of the number of ER-mitochondria contact sites; an impairment of the ER-mitochondrial Ca2+ flux; and an altered profile of the MAM proteome. These findings indicate TG2 is a key regulatory element of the MAMs.

(私訳と勝手な注釈) 

トランスグルタミナーゼタイプ2（TG2）は、ストレスがかかった細胞条件下でミトコンドリアのホメオスタシスに重要な役割を果たす多機能酵素です。 TG2インタラクトーム分析により、GRP75（グルコース調節タンパク質75）との酵素相互作用が明らかになりました。 GRP75はミトコンドリア関連膜（MAM）[*MAM=ERとmito間のMCSで良いかと]に局在し、IP3R-GRP75-VDAC複合体を組み立てることにより、小胞体（ER）からミトコンドリアへのCa2 +の輸送に関与し、2つのオルガネラ間の架橋分子として機能します。著者らはTG2とGRP75の相互作用がMAMで発生することを示します。 TG2-GRP75の相互作用を欠損させると、IP3R-3とGRP75間の相互作用が増加し[*恐らくTG2とIP3RでGRP75との結合を競合的に取り合っている]、ER-ミトコンドリア接触部位の数が減少し、ER-ミトコンドリア間のCa2+フラックスは障害され、MAMプロテオームのプロファイルが変化しました。これらの調査結果は、TG2がMAMの重要な制御因子であることを示しています。

*1:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124718318850#!

MICU1はミトコンドリアへの過剰なCaイオン流入を防ぐ門番である (Cell 2012年10月26日号掲載論文)

結論から言うと、MICU1がミトコンドリアへのCaイオン流入孔を形成するMCUの活性を調節することで、過剰なCa流入に起因するROSの産生やアポトーシスの亢進を防いでいることを示した論文。

本日は「MICU1 Is an Essential Gatekeeper for MCU-Mediated Mitochondrial Ca2+ Uptake that Regulates Cell Survival (MICU1は、MCUを介したミトコンドリアのCa2 +取り込みに不可欠な「ゲートキーパー：門番」であり、細胞の生存を調節する)」という論文で、米国 Department of Biochemistry, Temple University, Philadelphia の Dr. Muniswamy Madesh のグループによる研究。（論文サイトへのlink→*1）

ちなみにこの記事は、以前紹介した記事↓

sudachi.hateblo.jp

の補足記事でもあります。 

この前回の記事の中では、MICU1はミトコンドリアへのCaイオン流入を亢進させる分子として扱っていましたが、良く調べてみるとそんなに単純な話ではないようです。

前回の記事の論文中では、MICU1の機能として、2つの側面が述べられています。

1. 細胞質におけるCaイオン濃度が高いときに、ミトコンへのCa流入をある程度にまでとどめておき、過剰流入を防ぐ。

2. 細胞質におけるCaイオン濃度が低いときに、ミトコンへのCa流入をある程度亢進させる。

今回紹介する論文は、上記の1の話です。

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

Mitochondrial Ca2+ (Ca2+m) uptake is mediated by an inner membrane Ca2+ channel called the uniporter. Ca2+ uptake is driven by the considerable voltage present across the inner membrane (ΔΨm) generated by proton pumping by the respiratory chain. Mitochondrial matrix Ca2+ concentration is maintained five to six orders of magnitude lower than its equilibrium level, but the molecular mechanisms for how this is achieved are not clear. Here, we demonstrate that the mitochondrial protein MICU1 is required to preserve normal [Ca2+]m under basal conditions. In its absence, mitochondria become constitutively loaded with Ca2+, triggering excessive reactive oxygen species generation and sensitivity to apoptotic stress. MICU1 interacts with the uniporter pore-forming subunit MCU and sets a Ca2+ threshold for Ca2+m uptake without affecting the kinetic properties of MCU-mediated Ca2+ uptake. Thus, MICU1 is a gatekeeper of MCU-mediated Ca2+m uptake that is essential to prevent [Ca2+]m overload and associated stress.

(私訳と勝手な注釈) 

ミトコンドリアCa2 +（Ca2 + m）の取り込みは、ユニポーターと呼ばれる内膜Ca2 +チャネルによって媒介されます。 Ca2 +の取り込みは、呼吸鎖によるプロトンポンプによって生成されたミトコン内膜の膜電位（ΔΨm）によって促進されます。ミトコンドリアマトリックスCa 2+濃度は、その平衡レベルよりも5〜6桁低く維持されていますが、これがどのように制御されているかについての分子メカニズムは未知です。この論文では、ミトコンドリア蛋白質MICU1が、基底状態で通常の[Ca 2+] mを維持するために必要であることが示されました。MICU1を欠損すると、ミトコンドリアは過剰にCa 2+を取り込み、活性酸素種の生成とアポトーシスストレスに対する感受性が亢進します。 MICU1は、ユニポーター細孔形成サブユニットMCUと相互作用し、MCUを介したCa2 +取り込みのキネティックスに影響を与えることなく、Ca2 + m取り込みのCa2 +閾値を定義しています。したがって、MICU1は、MCUを介したCa2+取り込みの門番として機能しており、Ca2 +の過剰な取り込みと、それに関連するストレスを防ぐために不可欠な分子です。

*1:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867412012251#!

小胞体は、"膜のない"オルガネラとも接触する (Science 2020年2月31日号掲載論文)

結論から言うと、ERがP-bodiesやストレスgranulesなどのドロップレットともコンタクサイトと形成することを明らかにし、その接触点を基点にそれらのドロップレットが分裂することを示した論文。

本日は「Endoplasmic reticulum contact sites regulate the dynamics of membraneless organelles. (小胞体の接触部位は、膜のないオルガネラのダイナミクスを調節する)」という論文で、米国 Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 及び HHMI の Dr. Gia K. Voeltz のグループによる研究。（論文サイトへのlink→*1）

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

Tethered interactions between the endoplasmic reticulum (ER) and other membrane-bound organelles allow for efficient transfer of ions and/or macromolecules and provide a platform for organelle fission. Here, we describe an unconventional interface between membraneless ribonucleoprotein granules, such as processing bodies (P-bodies, or PBs) and stress granules, and the ER membrane. We found that PBs are tethered at molecular distances to the ER in human cells in a tunable fashion. ER-PB contact and PB biogenesis were modulated by altering PB composition, ER shape, or ER translational capacity. Furthermore, ER contact sites defined the position where PB and stress granule fission occurs. We thus suggest that the ER plays a fundamental role in regulating the assembly and disassembly of membraneless organelles.

(私訳と勝手な注釈) 

小胞体（ER）と他の膜に包まれたオルガネラが接触して相互作用することにより、イオンおよび/または、高分子の効率的な移動が可能になり、オルガネラ分裂のプラットフォームが提供されています。この論文で著者らは、processing bodies（P-bodies, PB）とストレス顆粒などの、膜で囲われていない、リボ核酸とタンパク質の複合体で形成される顆粒が、ER膜との間で形成する型破りな相互作用を報告しました。P-bodiesは、微調整が可能な様式で、ヒト細胞のERに分子距離でテザリングしていることを発見しました。 ER-PBのコンタクトおよびPBの生合成は、PBの組成、ERの形状、またERの翻訳能力を変化させることにより変動しました。 さらに、ERとこれらのdropletの接触部位が、PBおよびストレス顆粒の分裂が発生する位置であることが明らかとなりました。 したがって、ERは膜のないオルガネラのassembly, disassemblyの両方の調節においてfundamentalな役割を果たすことが示唆されました。

*1:https://science.sciencemag.org/content/367/6477/eaay7108.long