Rtn1がERの分裂を担う (Nature Communications 2019年11月22日号掲載論文)

結論から言うと、レティキュロン (reticulon) というタンパク質によってダイナミックなER膜の収縮と分裂が起きていることを示した論文。

本日は「Dynamic constriction and fission of endoplasmic reticulum membranes by reticulon (レティキュロンによる小胞体膜の動的収縮と分裂)」という論文で、イタリア Scientific Institute, IRCCS E. Medea, Laboratory of Molecular Biology の Andrea Daga のグループ（どういったラボ？→*1）による研究。（論文サイトへのlink→*2）

ERの大きさが、reticulonの分裂とatlastinによる融合のバランスによって動的に制御されている、という点が勉強になりました。

reticulonとatlastinは、それぞれ何によって活性を得たり失ったりするのでしょうかね。(例えば、ある生理的な条件でERが断片化する場合、reticulonが高い活性を持つようになる and/or atlastinの活性が失われる、という反応が起きているのでしょうか？)

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

The endoplasmic reticulum (ER) is a continuous cell-wide membrane network. Network formation has been associated with proteins producing membrane curvature and fusion, such as reticulons and atlastin. Regulated network fragmentation, occurring in different physiological contexts, is less understood. Here we find that the ER has an embedded fragmentation mechanism based upon the ability of reticulon to produce fission of elongating network branches. In Drosophila, Rtnl1-facilitated fission is counterbalanced by atlastin-driven fusion, with the prevalence of Rtnl1 leading to ER fragmentation. Ectopic expression of Drosophila reticulon in COS-7 cells reveals individual fission events in dynamic ER tubules. Consistently, in vitro analyses show that reticulon produces velocity-dependent constriction of lipid nanotubes leading to stochastic fission via a hemifission mechanism. Fission occurs at elongation rates and pulling force ranges intrinsic to the ER, thus suggesting a principle whereby the dynamic balance between fusion and fission controlling organelle morphology depends on membrane motility.

(私訳と勝手な注釈) 

小胞体は、細胞全体の連続的な膜ネットワークである。小胞体ネットワークの形成には、膜の湾曲 (curvature) や融合を作り出すタンパク質、例えばレティキュロンやアトラスチンなどが関与しています。しかし、様々な生理的状況下で発生するネットワークの断片化については、あまり理解されていませんでした。ここでは、ERのネットワーク分岐 (elongating network branches) をレティキュロンによって分裂するメカニズムが存在することを発見した。ショウジョウバエを用いた実験では、Rtnl1が促進するER分裂は、アトラスチンによるER融合によって相殺され、Rtnl1の方が優勢になるとERの断片化が生じた。COS-7細胞にショウジョウバエのレティキュロンの異所性発現をすると、ダイナミックなER tubules における個々の分裂イベントが可視化された。そのことと一貫して、in vitroでの解析により、レティキュロンは脂質ナノチューブの速度依存性の収縮を生じ、ヘミフィッション機構を介して確率的な分裂を引き起こすことが示されている。ERが持つ伸長速度と引張り力の範囲でER分裂が起こる。（*最後のin vitro解析の結果は、光ピンセットを用いた引張力の測定や数式によるkeneticsのモデリング等があり、正直あまりフォローできていません。）このことから、膜の運動性に依存した融合と分裂のダイナミックな均衡状態がオルガネラの形態を制御するという原理が示唆された。

*1:このグループはショウジョウバエを用いてERやMicrotubulesのダイナミクスを研究しているラボのようです。atlastinというタンパク質がERの融合を担っていることを報告したのもこちらのラボからです。 --https://moh-it.pure.elsevier.com/en/persons/andrea-daga より

*2:https://www.nature.com/articles/s41467-019-13327-7#Sec27

今週見た中で面白そうな論文（2020年5月第1週）

5月1日から5月10日の間で読んだ/積読したおもしろそうな論文のメモ。

神経シグナル伝達、シナプス小胞の形成・放出サイクルのエネルギー（ATP）消費が主

小胞サイクルの阻害で、ATP濃度倍増。活動電位のイオンチャネル阻害は濃度変化、微小

ラット培養海馬ニューロンのシナプス末端でATP、およそ1.4mM、ルシフェラーゼで測定

（Cell 誌より）https://t.co/uQlcfXglAQ

— Kazu Asakawa (@Kazuh_ideA) May 3, 2020

.@TJ_MeliaLab, Alf H. Lystad, and @simonsen_lab review the molecular mechanisms and membrane modeling events underlying #autophagosome biogenesis https://t.co/JYxOqILK5S #autophagy @CanCell_UiO @YaleCellBio pic.twitter.com/UepWZwjovZ

— JCellBiol (@JCellBiol) May 1, 2020

Happy to share our last review on mitophagy and iron in aginghttps://t.co/UGHILfZ1bo

— Strappazzon Flavie (@StrappazzonF) May 3, 2020

Hexokinase 2 displacement from mitochondria-associated membranes prompts Ca2+ -dependent death of cancer cells. - PubMed - NCBI

FBP1 loss disrupts liver metabolism and promotes tumorigenesis through a hepatic stellate cell senescence secretome | Nature Cell Biology

Unfolded Protein Response (UPR) Controls Major Senescence Hallmarks - ScienceDirect

機械刺激に応答した核のしなやかさ (Cell 2020年4月16日号掲載論文)

結論から言うと、
表皮幹細胞や皮膚組織などの伸縮刺激を受ける細胞群では、
機械刺激に応答して、Piezo1, Caシグナリングに由来するH3K9me3のメチル化レベルの減少が生じる
↓
これによってクロマチンの流動性が上昇し、核膜の張力が減少するため、核が軟化する
↓
機械刺激が分散することでDNA損傷が防がれる、
ということを示した論文。

本日は「Heterochromatin-Driven Nuclear Softening Protects the Genome against Mechanical Stress-Induced Damage (ヘテロクロマチンを介した核の軟化は機械刺激による損傷からゲノムを保護する)」という論文で、フィンランド Helsinki Institute of Life Science, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki の Sara Wickström のグループ（どういったラボ？→*1）による研究。（論文サイトへのlink→*2）

膜の張力を低下させることで刺激が分散される、という発想を持っていなかったので、読んでいて新鮮でした。勉強になりました。 

興味を持たれた方はabstractもどうぞ*3。

How can tissues maintain functional integrity during exposure to high levels of mechanical stress? Specifically, how does a cell's nucleus cope? Heterochromatin can dynamically rearrange its epigenetic state and architecture when stressed, which alters the mechanical properties of chromatin and the nucleus to mitigate DNA damage. Using mice, Nava et al. combined stem cell biology and mechanobiology to study epidermal stem cells and skin tissue that might be expected to experience stretching. Mechanical strain on epithelial sheets triggered stem cell nucleus deformation, which induced calcium release from the endoplasmic reticulum via Piezo1 channels. Calcium signaling altered the architecture, epigenetics, and mechanical state of heterochromatin to dissipate mechanical energy and minimize DNA damage. Stem cells subjected to continuous mechanical stress over longer periods of time became aligned perpendicular to the direction of strain to redistribute mechanical stress.

(私訳と勝手な注釈) 

高レベルの機械刺激にさらされている間、組織はどのようにして機能的な完全性を維持できるのでしょうか？具体的には、細胞の核はどのように対処するのでしょうか？ストレスを受けると、ヘテロクロマチンはそのエピジェネティックな状態と構造を動的に変化させることができ、これによりクロマチンと核の機械的特性が変化してDNA損傷を緩和する。Navaらはマウスを用いて、stem cell biologyとmechanobiologyを組み合わせて、日常的に伸縮刺激ににさらされていると考えられる表皮幹細胞と皮膚組織を研究した。上皮シート上の機械的なひずみは幹細胞の核の変形を誘発し、それが Piezo1チャネルを介して小胞体からのカルシウム放出を誘発した。カルシウムのシグナル伝達は、ヘテロクロマチンの構造、エピジェネティクス、機械的状態を変化させることで、機械的エネルギーを散逸させ、DNA損傷を最小限に抑えていた。また、機械刺激を長時間継続的に受けた幹細胞は、機械的ストレスを再分散するために、ひずみの方向に垂直に整列するようになった。

*1:このグループは単一の幹細胞が組織の中でどのように制御されているのかを研究しているラボのようです。-- Adult tissue-resident stem cells fuel renewal, repair, and remodeling of tissues to maintain their structure and function. Research in the Wickström lab aims to uncover how single stem cell behaviors are coordinated at the population level, and how population-level dynamics are coupled to tissue architecture. Uncovering these regulatory principles will facilitate the development of stem cell and regenerative therapies and more effective treatments against cancers. As a self-renewing organ maintained by multiple distinct stem cell populations, the skin epidermis represents an outstanding, clinically highly relevant research paradigm to address these questions. --https://www.helsinki.fi/en/researchgroups/stem-cells-and-tissue-architecture より

*2:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420303457#!

*3:今回はScience誌のEditor's choiceからの要約です

神経変性における、断片化ERとミトコンドリアが形成するコンタクトサイト (CNS Neuroscience & Therapeutics 2016年4月15日号掲載論文)

結論から言うと、
レーザー損傷による神経変性モデルの発生機序として、ERの断片化、ミトコンドリアのカルシウム濃度上昇, mPTPの形成, 膜電位の低下, 移動度の低下が提案され、
それらがERからミトコンドリアへのMCSを通したカルシウム移動に起因すること、MCS形成にはミトコンドリア膜電位が必要であること
が示唆された論文。

本日は「Mitochondrial Membrane Potential‐dependent Endoplasmic Reticulum Fragmentation is an Important Step in Neuritic Degeneration (ミトコンドリア膜電位に依存した小胞体の断片化は神経突起変性の重要なステップである)」という論文で、中国 Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences の Xing‐Guo Liu のグループ（どういったラボ？→*1）による研究。（論文サイトへのlink→*2）

まとめの図はこんな感じです(本文 Fig.6より引用)。 

ミトコンドリア膜電位の消失を誘導する脱共役剤としてFCCPが用いられていました。CCCPと同じ感じの試薬ですかね（なぜOligoと一緒に使うんだろう）。

あと、Calcein + コバルトでmPTPを評価する系も初見でした。フナコシの説明が分かりやすい。

最後の方の実験は、タプシガルギン(SERCAの阻害剤)を加えていましたが、なぜレーザーダメージの系から変えてしまったのだろう。。。カルシウムにfocusしたかったのですかね。

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

Background
Neuritic degeneration is an important early pathological step in neurodegeneration.

Aim
The purpose of this study was to explore the mechanisms connecting neuritic degeneration to the functional and morphological remodeling of endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria.

Methods
Here, we set up neuritic degeneration models by neurite cutting‐induced neural degeneration in human‐induced pluripotent stem cell‐derived neurons.

Results
We found that neuritic ER becomes fragmented and forms complexes with mitochondria, which induces IP3R‐dependent mitochondrial Ca2+ elevation and dysfunction during neuritic degeneration. Furthermore, mitochondrial membrane potential is required for ER fragmentation and mitochondrial Ca2+ elevation during neuritic degeneration. Mechanically, tightening of the ER–mitochondria associations by expression of a short “synthetic linker” and ER Ca2+ releasing together could promote mitochondrial Ca2+ elevation, dysfunction, and reactive oxygen species generation.

Conclusion
Our study reveals a dynamic remodeling of the ER–mitochondria interface underlying neuritic degeneration.

(私訳と勝手な注釈) 

概要
背景
神経突起変性は神経変性の重要な初期病理学的ステップである。

目的
本研究の目的は、神経突起変性と小胞体およびミトコンドリアの機能的・形態的リモデリングとを結びつけるメカニズムを明らかにすることである。

研究方法
ヒト多能性幹細胞由来の神経細胞において神経突起切断による神経変性モデルが用いられた。

研究成果
我々は、神経突起変性において、神経突起のERが断片化し、ミトコンドリアと複合体を形成することで、IP3R依存性のミトコンドリアCa2+上昇と機能不全が誘導されることを見出した。さらに、ミトコンドリアの膜電位は、神経突起変性時のERフラグメント化とミトコンドリアCa2+上昇に必要であることがわかった。短い「合成リンカー」を発現させてERとミトコンドリアのコンタクトを強めるとともにERのCa2+放出を行うことで、ミトコンドリアのCa2+上昇、機能障害、活性酸素の発生が促進されることが示唆された。

結論
私たちの研究では、神経突起変性の根底にあるER-ミトコンドリアコンタクトのダイナミックなリモデリングを明らかにしました。

*1:このグループはミトコンドリアの代謝や形態の変化・ミトコンドリア関連疾患のメカニズムを幹細胞を用いて研究しているラボのようです。-- Dr. Liu’s group has been focusing on mitochondrial and metabolic remodeling in cell fate determination, and mechanisms of mitochondrial diseases and therapy by stem cells. --http://english.gibh.cas.cn/sci/rp/LiuXingguo/ より

*2:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/cns.12547

SASPとERストレスのネガティブフィードバックループ (Molecular Cell 2015年9月3日号掲載論文)

結論から言うと、老化細胞において、macroH2A1がSASPを動員する遺伝子であり、SASPはERストレス, ROS, ATMの活性化を介してmacroH2A1の発現を抑える（つまりネガティブフィードバックループしている）ことを示した論文。

本日は「MacroH2A1 and ATM Play Opposing Roles in Paracrine Senescence and the Senescence-Associated Secretory Phenotype (MacroH2A1とATMはパラクラインによる細胞老化誘導とSASPで相反する役割を果たしている)」という論文で、米国 Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University の Matthew J. Gamble のグループ（どういったラボ？→*1）による研究。（論文サイトへのlink→*2）

この論文で明らかとなったpathwayは上図のとおりです。(論文サイトのgraphical abstより。わかりやすい。。) 

SASPが誘導されるような状況では小胞分泌を盛んにしないといけないので、もちろんERに負担がかかります。そこで誘導されるERストレスがSASPをやりすぎないように調節してるって訳ですねぇ。上手くできとる...！

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

Oncogene-induced senescence (OIS) is a tumor-suppressive mechanism typified by stable proliferative arrest, a persistent DNA damage response, and the senescence-associated secretory phenotype (SASP), which helps to maintain the senescent state and triggers bystander senescence in a paracrine fashion. Here, we demonstrate that the tumor suppressive histone variant macroH2A1 is a critical component of the positive feedback loop that maintains SASP gene expression and triggers the induction of paracrine senescence. MacroH2A1 undergoes dramatic genome-wide relocalization during OIS, including its removal from SASP gene chromatin. The removal of macroH2A1 from SASP genes results from a negative feedback loop activated by SASP-mediated endoplasmic reticulum (ER) stress. ER stress leads to increased reactive oxygen species and persistent DNA damage response including activation of ATM, which mediates removal macroH2A1 from SASP genes. Together, our findings indicate that macroH2A1 is a critical control point for the regulation of SASP gene expression during senescence.

(私訳と勝手な注釈) 

Oncogene-induced senescence（OIS）は、増殖停止、持続的な DNA 損傷反応、およびパラクリンによって老化の維持に寄与する senescence-associated secretory phenotype（SASP）に代表される腫瘍抑制機構である。ここでは、腫瘍抑制性ヒストン変異体であるmacroH2A1が、SASP遺伝子発現を維持し、パラクラインによる老化を誘発する正のフィードバックループの重要な構成要素であることを示している。OISの間に、マクロH2A1はSASP遺伝子のクロマチンから除去される等の劇的なゲノム全体の再局在化を受ける。SASP遺伝子からのマクロH2A1の除去は、SASPによって誘導された小胞体（ER）ストレスに起因する負のフィードバックループの結果である。小胞体ストレスは、活性酸素種の増加とATMの活性化を含む持続的なDNA損傷応答をもたらし、これがSASP遺伝子からのmacroH2A1の除去を媒介している。以上のことから、macroH2A1は、SASP遺伝子の発現制御に重要な制御点であることが明らかになった。

*1:このグループは細胞老化やガンとクロマチンの構造や機能の関連を研究しているラボのようです。Gamble先生っていう名前がまた良いですね。-- Histone variant macroH2A; Cancer; Cellular senescence; Chromatin structure and function; Transcription; Splicing; Senescence-associated secretory phenotype; Endoplasmic reticulum stress responses; Poly(ADP-ribose) polymerase--https://www.einstein.yu.edu/faculty/11838/matthew-gamble/ より

*2:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276515005699?via%3Dihub#!

カルシウム上昇に応答したER内腔と核膜の変化 (Cell 1997年6月13日号掲載論文)

結論から言うと、
平常時にはERの内腔を大きな分子が高速で拡散できるのに対して、細胞内Caイオン濃度が上昇すると急激に拡散の速度が低下し、腔内のタンパク質がfociを形成すること、
また、
細胞内Caイオン濃度上昇に応答して核膜上（または核膜と非常に近接した位置）にタンパク質が集合した大きな小胞が生じることを示した論文。

本日は「Calcium-Induced Restructuring of Nuclear Envelope and Endoplasmic Reticulum Calcium Stores (カルシウムストアである核膜と小胞体膜の、カルシウムによる再構築)」という論文で、米国 Department of Cell Biology, Duke University Medical Center の Tobias Meyer のグループ（どういったラボ？→*1）による研究。（論文サイトへのlink→*2）

本文ではERが断片化する、という表現が用いられていますが、個人的には断片化とは限らない気がします。ER膜タンパク質を標識してブチブチにちぎれている様子を見てみたかったです。

今回の系ではER内腔のタンパク質をGFPで標識していたため、かなり強烈にfociの形成が観察されましたが、もしかすると、ER膜はintactな状態で、中でタンパク質がアグっている or 拡散が遅くなるように区画化されてしまっているのかもしれません。

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

The spatial organization of endoplasmic reticulum (ER) and nuclear envelope (NE) calcium stores is important for the regulation of localized calcium signals and sustained calcium gradients. Here, we have used a lumenal GFP fusion protein and shown that, in resting cells, large molecules can rapidly diffuse across the cell within the lumenal storage space defined by the ER and NE membranes. Increases in cytosolic calcium concentration reversibly fragmented ER tubules and prevented lumenal diffusion. However, the integrity of the NE was maintained, and a significant fraction of NE lumenal protein accumulated in an NE-associated vesicle. These dynamic properties of ER-NE calcium stores provide insights into the spatiotemporal control of calcium signaling.

(私訳と勝手な注釈) 

小胞体（ER）と核膜（NE）のカルシウム貯蔵空間の空間的な調整は、局在化したカルシウムシグナルと持続的なカルシウム勾配の調節に重要である。ここで、我々は内腔GFP融合タンパク質を用いて、安静時の細胞では、ER膜とNE膜によって定義された内腔貯蔵空間内で、大きな分子が細胞全体に急速に拡散することを示した。細胞質カルシウム濃度の増加は、可逆的にER細管を断片化し、内腔拡散を防止した。しかし、NEの完全性は維持され、NE内腔タンパク質のかなりの割合がNE関連小胞に蓄積された。このようなER-NEカルシウム貯蔵の動的特性は、カルシウムシグナル伝達の時空間制御についての洞察を提供するものである。

*1:このグループはヒト細胞が、ホルモン・成長因子・細胞接触・ストレスなどをどのように感知しているのか、またそれをどのようにシグナルとして統合し伝達しているのか研究しているラボのようです。-- The Meyer lab seeks to understand how human cells sense hormones, growth factors, cell contacts and stress and how they integrate and transduce these signals to make decisions to polarize, move or divide.-- https://meyerlab.stanford.edu/research/ より

*2:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867400802810?via%3Dihub

Caイオン濃度上昇に応答した小胞体のネットワーク形成にRNA分解が関与する (Journal of Cell Biology 2014年10月6日号掲載論文)

結論から言うと、細胞内Caイオン濃度の上昇によりER局在RNaseが活性化し、RNA分解を通してERに局在していたリボソームやRNA結合タンパク質を遊離させることで、ERの形態（の大部分）がシート状ERからチューブ状ERに遷移する、というモデルを提唱した論文。

本日は「The calcium-dependent ribonuclease XendoU promotes ER network formation through local RNA degradation (カルシウム依存性リボヌクレアーゼXendoUは局所的なRNA分解を介してERネットワーク形成を促進する)」という論文で、米国 Department of Molecular Biology Massachusetts General Hospital の Michael D. Blower のグループ（どういったラボ？→*1）による研究。（論文サイトへのlink→*2）

モデル図はこんな感じです(本文のFig.7より引用)。

そもそもCaイオン濃度の上昇に応じてERの形態変化(Sheet状ERを減らしTube状ERを増やす)を誘導させる意義は何なのでしょうか。Tube状ERの方がCaイオン取り込みキャパが多いのですかね。

興味を持たれた方はabstractもどうぞ。

How cells shape and remodel organelles in response to cellular signals is a poorly understood process. Using Xenopus laevis egg extract, we found that increases in cytosolic calcium lead to the activation of an endogenous ribonuclease, XendoU. A fraction of XendoU localizes to the endoplasmic reticulum (ER) and is required for nuclear envelope assembly and ER network formation in a catalysis-dependent manner. Using a purified vesicle fusion assay, we show that XendoU functions on the surface of ER membranes to promote RNA cleavage and ribonucleoprotein (RNP) removal. Additionally, RNA removal from the surface of vesicles by RNase treatment leads to increased ER network formation. Using human tissue culture cells, we found that hEndoU localizes to the ER, where it promotes the formation of ER tubules in a catalysis-dependent manner. Together, these results demonstrate that calcium-activated removal of RNA from membranes by XendoU promotes and refines ER remodeling and the formation of tubular ER.

(私訳と勝手な注釈) 

細胞がどのようにして細胞内シグナルに反応してオルガネラを形成・再構成するのかは、あまり理解されていない。我々は、Xenopus laevis卵抽出物を用いて、細胞内カルシウムの増加が内因性リボヌクレアーゼであるXendoUの活性化につながることを発見した。XendoUの一部は小胞体に局在し、核エンベロープの組み立てと小胞体ネットワークの形成に必要とされる。精製した小胞による融合アッセイにより、XendoUが小胞体膜の表面で機能し、RNAの切断とリボ核タンパク質（RNP）の除去を促進することを示した。さらに、RNase処理により小胞表面からRNAが除去されることで、小胞ネットワークの形成が促進されることを明らかにした。また、ヒト組織培養細胞を用いて、hEndoUが小胞に局在し、触媒作用に依存して粗面小胞体の形成を促進することを見出した。以上の結果から、カルシウムにより活性化されたXendoUによる膜からのRNAの除去が、小胞体の形成・再構成を担うことが明らかになった。

*1:このグループはRNA局在と有糸分裂について研究しているラボのようです。-- Localization of RNAs to specific locations within cells and embryos regulates embryonic patterning, cell fate specification, cell motility, and cell division. Most localized RNAs are transported to their ultimate destination through the action of molecular motor proteins that move along cytoskeletal filaments. Interestingly, RNA is not localized to cytoskeletal filaments solely as passive cargo, but plays an active — translation independen t— role in mitotic spindle assembly.-- https://molbio.mgh.harvard.edu/laboratories/blower より

*2:https://rupress.org/jcb/article/207/1/41/37883/The-calcium-dependent-ribonuclease-XendoU-promotes